北京時(shí)間2025年3月13日，中國科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心范敏銳研究組與西湖大學(xué)吳旭冬團(tuán)隊(duì)、復(fù)旦大學(xué)張金儒團(tuán)隊(duì)及浙江大學(xué)蘇楠楠團(tuán)隊(duì)合作，于國際權(quán)威學(xué)術(shù)期刊《自然》（Nature）發(fā)表了題為“Structure and mechanism of the plastid/parasite ATP/ADP translocator”的研究論文，解析了葉綠體和衣原體ATP/ADP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的高分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，深化了人們對(duì)于葉綠體內(nèi)共生過程中跨膜能量傳遞的分子機(jī)制的理解。
眾所周知，線粒體是真核細(xì)胞的動(dòng)力工廠，生產(chǎn)生命活動(dòng)所需的能量——ATP。在線粒體內(nèi)膜上有一種被稱為AAC的ATP/ADP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它可以將ATP從線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)為各種代謝活動(dòng)供能，同時(shí)將ADP從細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體用于ATP合成。研究發(fā)現(xiàn)，植物細(xì)胞葉綠體（及其他質(zhì)體，如合成淀粉的淀粉體等）內(nèi)膜上也有一種被稱為NTT的ATP/ADP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它的功能恰好與線粒體AAC蛋白相反，NTT可將ATP從細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到葉綠體為代謝活動(dòng)供能，同時(shí)將ADP和磷酸根（Pi）從葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中（圖1a）。相比于線粒體AAC蛋白，葉綠體NTT是已知的底物特異性最高的ATP/ADP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，只能轉(zhuǎn)運(yùn)ATP/ADP而不能轉(zhuǎn)運(yùn)其它堿基種類核苷酸（如GTP/GDP、CTP/CDP等）和脫氧的dATP/dADP。研究表明，質(zhì)體NTT在植物光合作用、淀粉合成及脂肪酸合成等物質(zhì)和能量代謝過程中起重要作用。值得一提的是，硅藻中的NTT同源蛋白具有底物多樣性，不僅可以轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞內(nèi)的各種核苷酸，還可以轉(zhuǎn)運(yùn)人工設(shè)計(jì)的非天然核苷酸，在合成生物學(xué)領(lǐng)域有重要的應(yīng)用。
有意思的是，在衣原體等專性胞內(nèi)病原體（obligate intracellular pathogens）的細(xì)胞膜上也存在著類似于NTT的ATP/ADP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，負(fù)責(zé)將宿主細(xì)胞的ATP轉(zhuǎn)運(yùn)到病原體細(xì)胞內(nèi)為代謝供能（亦被稱為能量寄生）（圖1b），而一般的自生細(xì)菌（如大腸桿菌、藍(lán)細(xì)菌等）則不具有這種NTT蛋白。如果藍(lán)細(xì)菌沒有NTT蛋白，而根據(jù)內(nèi)共生理論葉綠體是由藍(lán)細(xì)菌進(jìn)化而來的，那么葉綠體的NTT蛋白從何而來呢？有猜想推測(cè)在內(nèi)共生過程中，最初一個(gè)真核細(xì)胞同時(shí)吞噬了固氮藍(lán)細(xì)菌和衣原體，由于固氮藍(lán)細(xì)菌需要消耗大量的能量進(jìn)行固氮，因此從衣原體通過基因水平轉(zhuǎn)移的方式獲得NTT這種轉(zhuǎn)運(yùn)ATP的膜蛋白，之后在進(jìn)化過程中便一直保留下來，逐漸成為葉綠體和其他質(zhì)體中不可或缺的一部分（圖1c）。特別值得一提的是，最近有研究將NTT蛋白引入到藍(lán)細(xì)菌中，在體外可以實(shí)現(xiàn)藍(lán)細(xì)菌在能量代謝缺陷型酵母細(xì)胞內(nèi)的共生，該共生體系統(tǒng)可存活達(dá)24代（圖1d）。
為了求證葉綠體NTT蛋白的來源問題并闡明其識(shí)別和轉(zhuǎn)運(yùn)ATP/ADP的分子機(jī)制，范敏銳研究組與合作者利用冷凍電鏡聯(lián)合納米抗體輔助，解析了來源于擬南芥葉綠體和肺炎衣原體的NTT蛋白的高分辨率三維結(jié)構(gòu)（2.9 ?-2.7 ?）。其中擬南芥葉綠體NTT蛋白的三個(gè)結(jié)構(gòu)分別處于外向開放態(tài)構(gòu)象和結(jié)合底物（ATP或ADP加Pi）的內(nèi)向部分開放態(tài)構(gòu)象，肺炎衣原體NTT蛋白的兩個(gè)結(jié)構(gòu)分別處于外向開放態(tài)構(gòu)象和結(jié)合底物（ATP）的內(nèi)向開放態(tài)構(gòu)象。結(jié)構(gòu)顯示NTT蛋白由12個(gè)跨膜螺旋組成，采取MFS（major facilitator superfamily）超家族的折疊模式，其中前6個(gè)跨膜螺旋組成N端結(jié)構(gòu)域，后6個(gè)跨膜螺旋組成C端結(jié)構(gòu)域（圖2a）。擬南芥葉綠體和肺炎衣原體NTT的結(jié)構(gòu)疊合顯示兩個(gè)物種來源差異巨大的蛋白質(zhì)具有非常相似的三維結(jié)構(gòu)（圖2b），印證了植物葉綠體NTT蛋白來源于衣原體相應(yīng)蛋白的猜想。
研究發(fā)現(xiàn)ATP分子（或ADP和Pi）的結(jié)合位點(diǎn)處于NTT蛋白的中央部分，位于N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域之間（圖2c,d）。ATP的結(jié)合涉及其三個(gè)部分（腺嘌呤、核糖和磷酸）與NTT的大量相互作用，其中，ATP的腺嘌呤部分被夾在芳香族和疏水氨基酸殘基之間，其帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)則與周圍帶正電的氨基酸殘基相互作用。ADP的結(jié)合位點(diǎn)與ATP類似，但是二者的構(gòu)象有所差別，ATP的磷酸基團(tuán)呈伸展的構(gòu)象而ADP的磷酸基團(tuán)呈折疊的構(gòu)象，因此周圍的互作殘基也略有差別。有意思的是，研究發(fā)現(xiàn)Pi的結(jié)合位置正好對(duì)應(yīng)ATP的γ磷酸基團(tuán)的位置。為了驗(yàn)證結(jié)構(gòu)上的發(fā)現(xiàn)，研究人員建立了基于化學(xué)發(fā)光的ATP/ADP交換實(shí)驗(yàn)以及基于放射性同位素的ATP-32P攝取實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)了一系列ATP/ADP結(jié)合位點(diǎn)的突變體，最終轉(zhuǎn)運(yùn)活性測(cè)定結(jié)果與結(jié)構(gòu)上的發(fā)現(xiàn)相吻合。此外，研究人員還通過NTT蛋白熱穩(wěn)定性分析發(fā)現(xiàn)Pi可以顯著促進(jìn)ADP的結(jié)合，提示二者的結(jié)合具有協(xié)同效應(yīng)，這與NTT的轉(zhuǎn)運(yùn)特性即ADP和Pi的共轉(zhuǎn)運(yùn)不謀而合。此外，研究發(fā)現(xiàn)如果將NTT中一個(gè)進(jìn)化上非常保守的天冬酰胺殘基（擬南芥AtNTT1中為N282）突變成丙氨酸，則其轉(zhuǎn)運(yùn)其他核苷酸（如GTP、CTP和UTP）的活性顯著增加，提示該殘基可能在NTT特異識(shí)別ATP中起重要作用。
另一方面，通過對(duì)比已解析的葉綠體和衣原體NTT處于不同構(gòu)象的結(jié)構(gòu)，結(jié)合突變體和功能實(shí)驗(yàn)，研究表明NTT的N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域是兩個(gè)相對(duì)剛性的部分，二者之間相對(duì)擺動(dòng)，通過改變兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的相互作用，來促進(jìn)ATP或ADP加Pi的結(jié)合、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)與釋放（圖3），其轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理符合MFS超家族的rocker-switch交替通路模型。
該研究不僅揭示了葉綠體和衣原體ATP/ADP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NTT識(shí)別和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)底物的分子機(jī)理，加深了人們對(duì)于葉綠體內(nèi)共生過程中跨膜能量傳遞機(jī)制的理解，也為改造NTT用于改良作物提高產(chǎn)量以及設(shè)計(jì)NTT抑制劑藥物治療專性胞內(nèi)病原體引起的疾病提供了重要思路。
中國科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心副研究員林華建、西湖大學(xué)博士生黃堅(jiān)、分子植物卓越中心科研助理李天明和博士后李文娟為共同第一作者，分子植物卓越中心范敏銳研究員、西湖大學(xué)吳旭冬研究員、復(fù)旦大學(xué)張金儒研究員及浙江大學(xué)蘇楠楠研究員為共同通訊作者。分子植物卓越中心博士生吳雨桐和楊天驕、博士后年宇薇、科研助理王睿瑛和趙曉慧，復(fù)旦大學(xué)碩士生林湘及浙江大學(xué)博士后王江勤也參與了該研究。感謝浙江大學(xué)、西湖大學(xué)和復(fù)旦大學(xué)冷凍電鏡平臺(tái)以及分子植物卓越中心公共技術(shù)服務(wù)中心的支持和幫助。感謝分子植物卓越中心同位素室徐乃旭和陳根云兩位老師的大力幫助。該研究得到分子植物卓越中心、中國科學(xué)院先導(dǎo)科技專項(xiàng)、中國科學(xué)院上海分院和上海市“科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃”的大力支持和資助。
論文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41586-025-08743-3
圖1. 葉綠體和專性胞內(nèi)病原體ATP/ADP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及葉綠體的內(nèi)共生過程和體外對(duì)內(nèi)共生的人工模擬。圖1c修改自L?ffelhardt, 2013; 圖1d修改自De et al, Nat Commun, 2024
圖2 擬南芥葉綠體NTT（AtNTT1）的結(jié)構(gòu)及其與肺炎衣原體NTT（CpNTT1）結(jié)構(gòu)的對(duì)比，以及AtNTT1的ATP結(jié)合位點(diǎn)
圖3 NTT介導(dǎo)的跨膜ATP/ADP轉(zhuǎn)運(yùn)過程
本文鏈接：http://m.020gz.com.cn/news-8-2762-0.html我國科研人員揭示葉綠體內(nèi)共生過程中能量傳遞的分子機(jī)制
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